Vyhodnocování "panelů" při diagnostice rakoviny pro Univerzitu Palackého v Olomouci
Desktopový program pro vyhodnocení spektrofotometrického testu. Program nahrává naměřená data, provádí jejich statistické zpracování a zobrazuje výsledné grafy. Na závěr generuje report v předepsaném formátu. Takto zpracovává více typů testů, kdy každý test má vlastní zpracování i reporty.
Program pomáhá s výzkumem rakoviny na Univerzitě Palackého v Olomouci.
Důvod vzniku a původní SW Chemorezist
Pro vyhodnocení reaktivity pacienta na podávaná cytostatika, případně testování potenciálních nových léků na buněčných linií rakoviny, se dá využít MTT test. MMT test se zjednodušeně realizuje pomocí „panelu“ malých jamek, naplněných testovanou látkou a podle zbarvení jednotlivých jamek se určuje účinnost dané látky, léku.
V laboratoři LEM se tento specifický test používá jak pro testování pacientských vzorků, tak i pro testování potenciálních nových cytostatik na nádorových buněčných liniích. Z povahy testu je jasné, že kvalitní vyhodnocení je vzhledem k časové náročnosti a přesnosti nutné co nejvíce automatizovat.
Zadání programu vycházelo z původního používaného a už ne zcela vyhovujícího programu Chemorezist, naprogramovaného v C++ s databází ve formátu dBase (dbf). Cílem bylo program kompletně zmodernizovat, vylepšit a přidat další funkčnost.
Obr. 1 - Ukázka jamkového panelu.
Program byl proto přepsán „from the scratch“ (tj. od základů) v C#. Z původního programu se využily pouze algoritmy výpočtů (a bohužel i v několika z nich byly objeveny nepřesnosti) a uložená databázová data. Ta se následně využila pro kontrolu výpočtů při automatizovaných testech výsledků. Data se ukládají na MSSQL server. Pro zobrazení výsledků panelu byla použita komponenta internetového prohlížeče, kde události „kliknutí“ se přenáší do aplikace. Program má připojenou knihovnu v Javě, která prokládá naměřené body křivkou (viz dále).
Princip MTT testu jednoduše
Princip testu MTT je ve své podstatě jednoduchý. Vezmeme buňky rakoviny (od pacienta nebo z buněčné linie při testování nových léků), přidáme k nim známé cytostatikum o známé koncentraci, k tomu pár chemikálií a pomocí průchodu světla změříme, kolik nádorových buněk „léčbu“ přežilo. Čím více jich přežije, tím je zabarvení roztoku tmavší. Samozřejmě je potřeba zabíjet nádorové buňky co nejvíc selektivně, jinak by byl nejlepší lék na rakovinu kyanid.
MTT test podrobněji
Přežití nádorových buněk se vyhodnocuje na základě spektrofotometrie. Tato metoda je založena na redukci žlutého solubilního 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyl tetrazolium bromidu (MTT) na nerozpustný formazan (modré krystaly hvězdicovitého tvaru). Reakce probíhá na mitochondriální membráně živých buněk. Formazan se rozpustí přidáním silného detergentu jako je dodecylsíran sodný (SDS), případně dimethylsulfoxid (DMSO). Zabarvení se vyhodnocuje spektrofotometricky při vlnové délce 540 nm. Hodnota absorbance roztoku odpovídá množství živých buněk (tmavší barva znamená vyšší absorbanci světla a tím vyšší procento živých buněk). Zbarvení jamek vzorku lze takto zhodnotit i pouhým pohledem. Spektrofotometrické měření je samozřejmě sofistikovanější, výsledek „přežití“ se počítá pomocí „blanku“ nebo „color blanku“ a „kontroly“. Počítá se hodnota EC, tj. kolik procent nádorových buněk přežije při dané koncentraci cytostatika. Důležitá je i hodnota EC50, tj. koncentrace, při které přežije 50% buněk.
Funkce aplikace
Z pohledu analytika se aplikace proti běžným „formulářovým“ databázovým aplikacím v některých věcech lišila. Nádorové buňky se inkubují v 96-ti jamkových panelech s různými cytostatiky (každé cytostatikum má svou koncentrační řadu). Součástí aplikace tak byla editace řad na 96 jamkovém panelu, viz obr. 2.
Tato nastavená „šablona“ panelu se pak používá například pro vyhodnocení účinnosti jednotlivých „základních cytostatik“ pro konkrétního pacienta. Na jeho nádor může zabrat různé cytostatikum, jedno z nastavených na panelu. V případě testů nového léčiva je situace pouze otočená, na známé buněčné linie se aplikují různé nově nasyntetizovaná potenciální léčiva.
Praktické měření pak probíhá tak, že se podle rozpisu ze šablony připraví 96-ti jamkový panel. Absorbance každé jednotlivé jamky se proměří na spektrofotometru, naměřený výsledek se v digitální formě přenese do programu. Program pomocí šablony „ví“ co která jamka znamená, vypočítá všechny potřebné výsledky a uloží je do databáze.
Další samostatnou kapitolou programu je práce s grafem. Při vyhodnocení se interpolací vypočítá hodnota EC50 (zmiňovaná koncentrace, při které přežije 50% nádorových buněk). Navíc tento program má připojenou i knihovnu (napsanou v Javě), která dokáže naměřené body grafu různým způsobem interpolovat teoretickými křivkami. Samozřejmostí je i odečítání hodnot grafu (viz obr. 3 a pole vespod grafu).
Obr. 4 - Vyhledávání diagnóz
Aplikace funguje i jako databázové úložiště. Obsahuje číselník diagnóz, dají se hledat výsledky pacientů, výsledky měření potenciálních cytostatik atp.
Obr. 2 - Editace 96-ti jamkového panelu. Nastavují se jednotlivá cytostatika a jejich ředění.
Obr. 3 - Hlavní formulář aplikace s jádrem internetového prohlížeče, které zobrazuje nastavení panelu.
Zkušenosti a výhody
Program už ve fázi analýzy zlepšil měření, protože se upravil algoritmus výpočtu EC. Dále zrychlil celé vyhodnocení tohoto laboratorního testu cytostatik, protože výpočty probíhají ihned pomocí strojových dat ze spektrofotometru. Zrychlil celou „byrokracii“ kolem vyhodnocení pacienta, protože automaticky „předpřipraví“ k tisku i protokol s vyhodnocením, viz obr 5.
Program se stále používá a nedávno byl zaktualizovaný.
Obr. 5 - Protokol vyhodnocení pacienta.
